第四节　有机溶剂健康危害常见研究方法

一、病案研究

临床病案是医生与患者接触所获得一系列证据的记录，其中包括患者的疾病史、职业史、毒物接触史、阳性/阴性体征、各项检验结果以及临床处置资料等，是十分宝贵的人体毒理学资料来源。在有机溶剂健康危害的研究方面，其作用可以体现为提供某种有机溶剂可能导致某种临床疾病的证明，或提示发生职业性化学中毒可能的毒物和特定的风险状况，临床病案中记录的临床处置资料与病程变化对中毒急救也具有重要价值。

临床病案分析是一种传统的研究方法。最初接触一种未知的致病因素时，往往在造成极为严重的后果（临床病例或最终的病理解剖）后，才能逐步通过体内外试验与流行病学研究明确病因，最终予以预防。部分有机溶剂的毒性研究是以相应的病例报告为起点的，从中可以识别有机溶剂与某些症状或疾病的潜在关联，如较早期的苯与骨髓造血抑制性、甲苯与小脑性运动失调、二硫化碳与帕金森病之间的关系等都是来源于临床案例。尽管临床病案研究并不完全符合预防为主的原则，但也有助于研究者确定有机溶剂毒作用的主要靶器官，为之后的流行病学调查、剂量-反应关系评定、毒性机制研究提供方向和依据。通过对临床病例生化指标的检查和长期跟踪随访，还有助于明确有机溶剂在人体内的毒代动力学特性，以及有机溶剂的长期健康影响。

此外，当有机溶剂集体中毒事件发生时，临床病案也是较为敏感的资料来源。当一段时间内临床出现大量症状相似、职业接触史相同的病例时，医生通过经验分析判断，往往能够锁定可能的毒物，有助于中毒事件发展的控制与职业卫生调查的进一步开展。在典型案例病因分析的基础上，还可以帮助改进不合理的生产工艺、设备、厂房布局等，并能够为有效落实用人单位职业病防治主体责任、完善工伤保险制度和建立健全相关制度规范等提供建议。

二、流行病学调查

有机溶剂危害的流行病学调查是流行病学在有机溶剂职业接触人群中的具体应用，指以有机溶剂职业接触人群为研究对象，运用流行病学理论与方法研究有机溶剂接触对健康的危害及其发生、发展、分布、频率与影响因素的研究方法。流行病学研究在许多有机溶剂健康危害的发现与证实过程中发挥着不可替代的作用，特别是对于致癌等长期毒作用。此外，有机溶剂对职业人群的精神和心理影响等方面的研究，也只有借助流行病学手段才能够开展。

（一）流行病学研究设计类型

有机溶剂危害的流行病学研究大体可分为横断面研究、病例对照研究、队列研究与干预研究。

横断面研究指通过对特定时间某地区、某职业人群健康状况与有害溶剂接触水平等资料的收集，了解职业人群有机溶剂暴露与健康或疾病状况的分布情况，进而提供病因线索。在我国职业病研究历史上，自20世纪70年代起，就陆续对苯等物质所致的职业性化学中毒进行了大规模普查，不仅明确了发病情况，也大大推动了职业病的诊断标准与防治管理的发展，目前已成为职业病监测必不可少的手段之一。横断面研究在确定有害因素与疾病的因果联系方面较弱，无法得出具有普遍意义的科学结论。

病例对照研究属于回顾性研究方法，指对于某种已知的健康损害由果及因寻找可能的暴露因素，是评价和筛选职业病病因的重要手段。病例对照研究对于探究一些特殊有机溶剂导致的罕见疾病表现（致癌、致畸等）具有重要意义，此外也有助于发现新的有机溶剂危害。但病例对照研究通常仅局限于一种疾病或状态的研究，难以满足实际工作中对职业病危害因素进行全面评价的要求。

队列研究包括前瞻性队列研究、历史性队列研究与双向性队列研究，指固定研究对象，观察有机溶剂暴露对健康的影响，由因到果获取该因素在职业人群中的分布情况及其健康影响（发病率、死亡率）。此类研究结果可以帮助验证某种有机溶剂引起的已知危害或探索其可能存在的新的危害类型，同时可以获取某地区或某行业该溶剂危害的严重程度与发展变化规律，更加符合职业流行病学的目的要求。员工健康档案、职业卫生监测数据等资料保存的逐渐规范化，使得历史性队列研究的应用更为广泛，特别是在职业病危害因素致癌作用等潜伏期或观察期较长的疾病方面。

干预研究又称防治试验研究，是实验流行病学中人群现场试验的一种。研究过程中将研究对象随机分为试验组与对照组，试验组针对病因给予人为干预措施，对照组不施加干预，前瞻性随访各组结局变量并比较，判断干预措施效果。由于干预研究对研究人群施加了人为干预因素，应特别注意研究过程中涉及的伦理问题。

（二）职业流行病学研究特点与问题

流行病学在职业卫生领域应用时，其研究设计要求以及常见的偏倚与一般流行病学基本一致，但也有职业流行病学的特点。

1.研究特点

①研究对象的特殊性：职业流行病学的目标对象是职业人群，与一般人群相比稳定性较高，通过就业记录与健康档案即可获得该人群职业接触史与较为连贯的健康状况资料。②职业暴露（接触）较为明确：对于特定的职业人群，在其生产过程中接触的职业病危害因素是比较明确的，且接触水平往往较高，接触水平能够通过工作场所监测以及生物监测手段进行具体检测，并有助于阐明有害因素接触的剂量-反应（效应）关系。

2.存在的问题

①存在健康工人效应：由于上岗前、在岗期间定期职业健康检查等医学检查的实施，企业将拒绝患有严重疾病以及存在职业禁忌证的人员从事相关职业，并将那些已经受到职业有害因素影响的人员调离原岗位，这些因素不仅使得在岗工人初期的身体素质高于一般人群，也有可能出现随工作时间增加有害因素致病证据反而减少的矛盾现象，在流行病学调查中需要格外注意。②职业暴露（接触）剂量评估的复杂性：实际的生产过程中，工人接触的化学物质种类十分复杂，尤其是在印刷、橡胶等有机溶剂使用行业，往往同时存在多种溶剂的联合暴露，部分成分存在性质不清、剂量不明的情况。生产工艺的不断改进、岗位变动、长期监测资料中检测方法的前后不一致、劳动者个人防护措施与卫生习惯的差异等多种因素都增加了真实有害物质暴露评估的复杂性。③常存在应答偏倚：职业流行病学调查存在企业与劳动者双方的特殊利益关系，在得知调查目的后，可能会缺乏充分的合作或得到职业性有害因素对健康影响的放大结果。

（三）分子流行病学的应用

分子流行病学（molecular epidemiology）是应用先进的分子生物学技术测量生物学标志的分布情况，结合流行病学现场调查研究方法，从分子或基因水平阐明疾病的病因及其致病过程，并研究疾病防治和促进健康的策略和措施的科学。

在有机溶剂危害分子流行病学研究中，接触剂量从外暴露剂量的粗略估计过渡到内剂量和生物有效剂量的测定，有些生物标志物能够综合多途径进入机体的毒物与一段时间内接触毒物的总和，更准确地反映机体与靶组织实际的接触剂量。而生物有效剂量标志物，如DNA与蛋白质加合物，能从机制上更好地研究有机溶剂的毒性作用。流行病学的研究结局也不再受限于临床症状或体征，而可以定义为从溶剂接触到疾病/ 死亡结局连续谱中的任一时相，如遗传学的改变、代谢酶及激素水平变化等，这使得在揭示毒性机制的同时，也有利于发现早期可逆的健康损害。此外，分子流行病学在筛选易感人群，减少接触风险方面也有不可估量的价值，如细胞色素氧化酶P450 2E1（CYP2E1）与谷胱甘肽硫转移酶（glutathione S-transferase，GST）等一系列参与苯代谢的关键酶的基因多态性可以影响个体苯中毒的易感性，此类基因多态性研究可以筛选出易感性生物标志物，预测个体易感性，针对性地保护易感人群。

三、动物实验

动物实验是有机溶剂毒理学研究的传统手段。实验过程中可以人为控制现实中无法排除的干扰因素，更清晰地认识暴露与疾病的关系，深入探究疾病的发生、发展规律与机制及有效的干预方法。由于新的有机溶剂不断涌入市场，动物实验的需求也大大增加，能够在人类接触毒物前提供毒性评估资料并制定一个暂时性的接触阈剂量，是目前有机溶剂毒性研究不可缺少的重要环节。

动物的选择是开展实验首要考虑的问题，一般需要遵循相似性原则，即尽量保证实验动物在组织结构、系统功能、生理特性、繁殖、发育等方面与人类近似。对于有机溶剂的毒性研究，传统的实验动物主要是啮齿类。近年来，由于斑马鱼的部分器官系统、早期胚胎发育以及基因等方面与人的相似性，也被逐渐应用于人类疾病模型的构建中，如有机溶剂三氯乙烯的心脏发育毒性机制研究、甲醇和乙醇等溶剂对胚胎发育毒性研究、二甲基亚砜等有机溶剂对眼睛发育的影响研究等都使用了斑马鱼作为模式动物。随着基因组学技术的成熟，为了精准探究有机溶剂毒性的分子机制，转基因动物与基因敲除动物等基因修饰动物正被广泛应用，如用Cyp2e1基因敲除小鼠探索苯等溶剂的毒作用机制。

动物实验的染毒方式主要可分为经口、吸入、经皮与注射染毒，不同染毒方式建立模型时是否能模拟出人体健康效应以及建立模型所需的时间、靶组织器官的选择性及损伤的严重程度、毒物在体内的毒代动力学特性等，均是控制实验质量必须考虑的问题。尽管染毒方式常考虑与人群接触途径保持一致，但实际工作中还需根据研究目的与实际用途进行合理选择。

染毒剂量一般根据染毒方式、实验动物物种决定。由于实验研究中动物的数量远远少于毒物接触人群的实际数量，为了用较少的实验动物获得有统计学意义的结果，实验中往往采用较高的染毒剂量并设多个剂量梯度，以便于获得化学物的毒性效应与相应的毒性参数。实验动物的种属品系差异、不同染毒途径、接触剂量差异等所导致结果外推的不确定性，使得无法仅根据动物研究得出关于人类疾病致病原因的明确结论。

四、体外试验

体外试验是利用离体的器官、组织、细胞、亚细胞组分、提纯的分子以及微生物等材料在合适的条件下研究物质毒性与机制的方法。相比于利用完整生物体（包括人）的体内试验，体外试验更符合实验动物伦理学原则。利用人来源的组织、细胞等生物材料还可以实现物种特异性研究。

（一）离体器官与组织

器官灌流是毒理学研究的重要手段。利用灌流技术可以在一定时间内保持离体脏器的生理活性，其间需要注意维持灌流液的pH值、氧含量，还要控制适宜的灌流液流速。在灌流液中加入受试外源性化学物，可以观察脏器出现的形态和功能变化以及受试物在脏器中的代谢情况，如用肝脏灌流的方法研究四氯化碳、三氯甲烷、二氯甲烷、苯和环己烷等溶剂引起胆汁淤积的机制，以及四氯化碳中毒对其他化学物如乙醇、乙醛代谢的影响等。离体组织也可用于有机溶剂的危害性研究，常用离体的人体皮肤或猪等动物来源的皮肤组织，从中获取有机溶剂的经皮渗透性数据，可用于意外接触的风险评估或预测模型的开发和建立。

（二）脏器切片

肝脏、肾脏、大脑与心脏均可制备切片，脑片和心肌条等需将组织片置于恒温的孵育液中进行有关试验研究，其中脑切片常用于乙醇毒性研究。有机溶剂研究中更多使用肝脏组织切片，可从低温保存的组织中获取。该模型能够保留肝脏的生化功能，相比脏器灌流，操作也更加简便，但使用时需考虑受试物在组织中的渗透能力。

（三）细胞培养

体外细胞毒性试验所选取的细胞类型因受试物的不同而不同，原则上应尽可能反映受试物毒性且易培养、易操作。细胞来源可分为从人和动物机体分离后立即培养的细胞，又称为原代细胞（primary culture cell），包括肝细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、神经元细胞和心肌细胞等，以及经传代培养得到的细胞株（cell strain）和细胞系（cell line）。化学物毒性研究常用大鼠肝脏与人肝脏的原代细胞模型，受试物接触条件易控制，但细胞间结构被破坏，细胞内代谢酶活性也会随着培养时间的延长而下降，如细胞色素P450（cytochrome P450，CYP450）活性在24～28小时会降低50%左右。细胞毒性试验常见的评价指标有细胞生长抑制或去抑制、细胞死亡、代谢活性改变、亚细胞水平的损伤和病变、离子通道活性改变、基因表达改变等。随着基因组学、蛋白组学等多组学技术的兴起，转基因细胞系得以建立，细胞水平上进行的以基因功能与蛋白作用为主要研究内容的细胞组学也正在形成与发展。

（四）亚细胞组分

细胞匀浆后经离心获得的细胞结构或细胞器亦可直接用于毒理学研究，使用较多的包括细胞膜、微粒体和线粒体等。其优点在于可以避免化学物转运等带来的影响，如体外用肝细胞微粒体研究毒物代谢时，毒物消耗可完全反映酶的代谢功能。

（五）分子水平研究

分子水平研究主要以核酸、蛋白质等生物大分子为研究对象，传统的测定手段包括核酸分子杂交技术、PCR技术、蛋白质印迹技术等。目前迅速发展的基因测序技术、生物芯片技术、表观组学技术及代谢组学技术等高通量测试方法能够实现快速测定大量DNA、mRNA、非编码RNA与蛋白质的特征性表达和代谢产物，对比基因与蛋白的表达差异和差异代谢物有助于明确基因的功能及调节，深入探索毒作用机制，找寻与毒作用相关的生物标志物。

体外试验研究尽管在特定条件下具备部分取代动物实验或减少动物使用的能力，但检测终点较为单一，无法真实反映毒物在体内的动力学过程与机体的网络调控作用，因而从体外试验得到的结果外推到完整生物体存在不确定性，研究者必须避免对体外试验结果的过度解释，以减少关于机体与系统生物学错误结论的产生。

五、计算（预测）毒理学

计算（预测）毒理学是一种高效、高通量的进行化学品风险预测管理的技术，也是对传统实验毒理学的补充和扩展。其融合毒理学、计算化学、化学/生物信息学、系统生物学等多学科资源，通过研究化学品结构与理化属性、各类效应之间的关系规律，结合相关剂量数据与人体暴露情况，构建出多水平、多尺度的预测模型，以进行化学品风险排序与安全性评估。

计算（预测）毒理学中化合物的毒性预测方法主要分为两种，一种是基于已有知识和规则的专家系统，另一种则是基于统计分析自动产生结构与性质关系的方法。无论何种方法，核心都是化合物结构与性质之间的关系。在计算（预测）毒理学领域，常用的代表模型为定量结构-活性关系（quantitative structure-activity relationship，QSAR）模型（图1-1）。研究往往认为分子结构是决定化合物理化属性、环境迁移转化行为和多种生物效应的内因，QSAR模型能够将研究者感兴趣的因变量（效应）与一组自变量（通常是计算出的属性或描述符）相关联以预测未知的效应。

暴露模拟时，通常从化学品源排放出发，构建不同尺度模型来估算环境中化学品浓度水平，预测其环境行为、暴露模式，利用生理毒代动力学（physiologically based toxicokinetics，PBTK）模型模拟化学物质在生物体内的吸收、分布、代谢与排出行为。在毒性模拟方面，有害结局通路（adverse outcome pathways，AOPs）概念所假设的分子起始事件触发一系列反应直到产生宏观有害效应，也同样具备生物大分子、细胞、组织、器官等多尺度特性。在不同尺度都拥有各自的模拟方法和体系，例如分子水平上的以靶分子结构为基础的分子机制法，细胞水平的计算系统生物学通路（computational systems biology pathway，CSBP）模型，虚拟组织、虚拟器官模型等。

虽然计算（预测）毒理学能够摆脱仅使用实验来解决毒性评估问题，但尚无法取代传统实验研究，不仅计算化学方法仍然会使用到经验参数，预测模型所依赖的高质量数据库的构建也需要传统毒理学实验获得的数据和证据。此外，由于传统的计算毒理学方法依赖于建模化合物结构的相似性与测试条件的一致性，更适用于简单毒性的预测，而对于机制不明确或较为复杂的致癌、致畸及致突变等毒性效应，暂时很难实现高预测模型的建立。随着基因组学、蛋白质组学和代谢组学等实验技术的进一步发展，将会得到更多可用于计算和预测的毒理组学数据，新软件、新计算方法的开发和建立，系统生物学等新思路的应用将会使得计算（预测）毒理学得到更大发展。解析复杂毒性机制，建立机制更透明、更通用、预测结果更精确的毒性预测方法，实现动物模型的替代，是今后计算（预测）毒理学的发展趋势。