第二节 常见生物标本的采集和保存操作规范

近年来，随着肿瘤的临床和基础研究不断深入，越来越多的研究证据表明，通过发展新的临床样本检验方法和技术来筛选并鉴定肿瘤生物标志物对于提高肿瘤早期诊断率是有益的。肿瘤生物标志物检测为肿瘤的早期诊断，以及指导个体化治疗提供更多可能。

肿瘤生物标志物是指肿瘤细胞在肿瘤发生和发展期间产生，或者由机体对肿瘤细胞反应而产生，并分泌和释放到血液、细胞或体液中，用来反映肿瘤存在和生长的化合物（包括激素、癌胚抗原、糖蛋白、酶和同工酶及癌基因产物等）。这些物质在正常组织和良性疾病中不产生或产生的量极微，可以通过免疫、化学和分子生物学等各类方法进行检测。因此，通过测定肿瘤标志物的水平，可以为恶性肿瘤的早期诊断、疗效观察、预后判断和肿瘤复发进行监测，有利于提高癌症患者的生存率并显著改善生活质量。

肿瘤标志物检测的重点在于建立规范化和可操作性的生物标本采集和保存方法。据国内外研究报道，60%～70%的实验误差来自实验前（分析前），当标本收集方法不当时，例如前列腺按摩、穿刺和结肠镜检查将增加血液中的PSA和PAP水平；酶和激素类肿瘤标志物不稳定且易于降解，需要及时检测或者冷冻保存样本。此外，仪器、试剂、质控品和标准品不能解决预测试（预分析）的错误。因此，必须严格做好实验前质量管理，而生物标本的采集和保存是实验前质量管理的关键内容。

一、常见生物标本的采集

目前，对肿瘤标志物的研究主要集中在以下几类标本的检测：组织，血液，尿液，粪便；其他体液及从血液，骨髓，尿液或痰液分离出的肿瘤细胞或肿瘤DNA等。

（一）组织

迄今为止，身体器官、组织、细胞和亚细胞结构的形态变化仍然是肿瘤诊断的最直观和可靠的指标。在组织病理学研究中，组织切片的质量直接影响病理诊断结果的准确性和可靠性。因此，为达到正确诊断和观察的目的，应根据需要确定取材的部位，并规范采集和处理病理组织标本流程。

1.组织收集原则（包括手术和活检组织样本）

（1）临床诊断明确，未经放疗和化疗的手术切除标本均在病理医师的指导下进行取材。

（2）尽量确保癌组织不坏死（坏死标本难以提取高质量的RNA和蛋白质）。

（3）配对的“癌旁组织”应该选择距离癌灶边缘3cm范围内的组织样本，配对“正常组织”选择距离癌灶边缘5cm以上或者癌灶边缘最远段（或手术切缘处）的组织样本，并指明距离。对于空腔器官（胃、食管、胆囊、肠、膀胱等）的“癌旁组织”和“正常组织”应选择相应的“黏膜组织”样品。

（4）在确保病理检查所需标本的前提下，尽量提供足够量的肿瘤和邻近的正常组织，一般不少于1～2g或107个细胞。

2.组织保存原则

（1）手术期间取出的组织样本必须快速置于液氮中，并储存在液氮罐或-80℃冰箱中。

（2）用于形态学观察和显微切割的组织可用OCT处理后冻存。

（3）如有需要，可根据标准操作规程提取肿瘤组织的DNA、RNA和蛋白质，并按要求放在-70℃长期保存。

（4）将新鲜组织在甲醛溶液中固定后制成石蜡包块于-20℃长期保存。

（二）血液

临床试验血液样本分为三种类型：血清、血浆和全血。临床常用标本为血清和血浆。

血清：在样品离心前，让其自行凝集。通常，在室温（22～25℃）下放置30～60分钟的血液样品可以完全凝集。

血浆：当需要血浆样品时，必须使用含有抗凝剂的血液样品采集管，采血后立即将采血管轻轻颠倒5～10次，以确保抗凝剂发挥作用。

全血：将人体内血液采集到采血管内所形成的混合物，即包括血细胞和血浆在内的所有成分。

1.患者准备

（1）控制饮食，禁食浓茶、咖啡、高糖及碳酸类饮料等。

（2）避免剧烈运动，应在平静状态下抽血。

（3）某些药物可能影响肿瘤标志物的浓度，因此要注意避免药物对检验结果的影响。

2.血液标本的采集

（1）使用抗凝真空采血管收集外周血液标本，初次就诊患者采集3～5ml血样。

（2）对于特殊病例，应保存治疗前后血液标本各5ml（血浆或血清）。

（3）临床诊断后，应在术前采集血液标本，术后第14天或出院前再次取血。

（4）根据临床试验操作规程和技术标准进行化疗前后血浆或血清标本采集。

（5）选择性别、年龄与实验组相匹配的非癌患者为对象，采集非癌患者/正常对照血浆或血清样本。

3.血液样本的保存

血液标本采集后应立即检测。若不能及时测定，应将采集好的全血、血浆或者血清样本转移至单独的冻存管，按照400～500μl/管分装好。短期保存，可放入-20℃或-70℃冰箱。长期保存，请放入液氮。且应避免反复冻融。

（三）尿液

尿液样本采集通常由患者独立完成，患者的年龄、性别、情绪、运动、饮食及药物都可能影响检验结果。尿液标本采集的基本原则是尽量减少运动、禁食某些食物、并在必要时停止使用某些药物等。在取样之前，医务人员应告知患者正确的采集方法，以避免混入经血、阴道分泌物、粪便、精液等。对于重症患者、昏迷患者、婴儿或其他无法自行采集尿液标本的情况，医务人员应参与尿液采集过程。此外，医务人员应该熟练掌握无菌技术以收集导尿管尿液。

1.尿液脱落细胞学标本采集

（1）所有患者在入院后无导尿、膀胱镜检查、直肠指诊等泌尿系统相关操作之前，留取新鲜清晨清洁中段尿100ml。

（2）尿液标本收集后需及时离心处理，尿脱落细胞学检测应将尿液离心并收集沉淀进行染色涂片，此操作需要在2小时内完成。

2.尿液可溶性肿瘤标志物标本的采集

（1）晨尿或随机尿的中段尿均可以用于检测肿瘤标志物，体积约50ml。随机尿与上次尿间隔3小时以上。

（2）将尿液离心后，取上清液进行检测。

3.尿液的保存

尿液留取后应及时检测；如果必须推迟检测或者收集24小时尿液样本，则应将其储存在4℃冰箱或化学防腐剂中（甲苯、甲醛溶液、麝香草酚、碳酸钠、浓盐酸等）。尿液样本如果不能在24小时内检测，应收集后立刻分装，-20℃以下冻存，并避免反复冻融（其中NMP22检测必须在收集到尿液样本后2小时内进行）。

（四）粪便

1.采用无菌容器收集用于培养的粪便标本，大便常规标本使用大便瓶或者药袋。

2.挑取2～3g含有黏液或脓血等异常成分的粪便。如果粪便外观没有明显异常，应在粪便内外多处取样。

3.如果没有粪便排出但又必须进行检验时，可以将蘸有无菌生理盐水或增菌液的直肠拭子插入肛门4～5cm（儿童2～3cm），擦取直肠表面的黏液后取出，盛于无菌试管或保存液中送检。

4.粪便标本应该是新鲜的，最好在1小时内完成检测。时间过长可因pH发生改变或者消化酶的作用使有形成分分解破坏及病原菌死亡而导致检测结果出现偏差。

（五）脑脊液

1.采集量 至少1ml。

2.穿刺位置 第3至第5腰椎间隙。

3.记录采集时间 脑脊液的蛋白质浓度受昼夜节律的影响，故应准确记录采集时间。

4.弃掉血性脑脊液 尽管可以通过离心去除红细胞以降低血液对脑脊液检查结果的影响，但是当红细胞数超过5.0×108/L时，建议弃掉标本。

5.采集管 应使用聚丙烯采集管，不推荐使用易碎的玻璃管。

6.采集脑脊液时应留取血清、血浆和DNA。

（六）胸腹腔积液及浆膜腔积液

临床医师行无菌穿刺术进行采集，最好留取中段液体放入含有抗凝剂的无菌容器内，并立即送检。

（七）痰液

咳痰前患者准备：①刷牙或反复漱口，以避免食物残渣混入痰液中；②吐出口腔中所有唾液，并弃去喉咙里的头两口痰。

1.向患者和家属解释痰液检查的方法和目的，使患者能够充分配合，认真咳痰，以获得满意的痰液标本。

2.若患者大量咯血，则待出血完全停止后再咳痰检查。

3.当患者因痰少或黏稠而难以咳出时，可适当口服、雾化吸入或者静脉输入化痰药，使痰液稀释，以利于痰液排出；支气管冲洗液也可以用于细胞学检查。

痰液标本一般连续3天送检，以提高阳性检出率。痰标本涂片镜检应有大量上皮细胞及尘细胞，否则应该重新留取标本。

（八）支气管肺泡灌洗液（BALF）

应在刷检和活组织检查前进行支气管肺泡灌洗液采集，以避免血液污染。将纤维支气管镜的前端嵌入病灶的肺段，并在输注20ml生理盐水后立即通过负压回收支气管肺泡灌洗液，反复进行3次，离心收集上清液至-20℃保存待检。

（九）支气管刷检和其他穿刺细胞学检查

对于支气管刷检和其他穿刺细胞学检查，要求涂片均匀并且厚度适中，不能拖拉和过分挤压细胞，以免细胞变形，并尽量避免大量血细胞残留涂片上影响病变细胞的观察。

二、生物标本的保存和加工

生物标本的分装、标记和保存至关重要，有些标本要在几年或更长的时间以后才会用于实验研究，因此质量监控和检索的方便尤为关键。

1.标准化实验记录，提供长期、连续的数据资料，以确保准确反映样本质量，避免在未来的研究中产生偏差。特别是生物标本储存条件，包括温度变化与标本质量之间的关系。

2.所有生物标本应分装保存，尽量避免反复冻融。需要长期保存的样品最好储存在液氮或-135℃。

3.储存生物样品的容器为螺口式冻存管，可在低温下长期保存，避免使用玻璃管或弹出式盖子的管子。

4.用于存储样品的标签为条形码，并且存储生物样品的每个容器应该有唯一且清晰的识别符号，其可以牢固附着在容器上，并且耐受低温储存条件。所有相关信息可以和这个唯一的识别符相联系，包括参与研究人员的保密性、数据的安全性和知情同意协议。

5.拥有自动化的安全保障系统以连续监控样本保存设备的运行状况。应考虑在至少两个不同的位置储存特别有价值的生物样品。

6.需要专业人员负责，如具有使用生物样品从事实验研究经验的人员，并且需要定期进行专业培训和考核。

7.为了充分有效地利用生物样品资源，有必要在收集标本的同时进行如DNA、RNA、蛋白质的提取和保存等标本的深加工处理。

三、标本采集与保存注意事项

正确的标本采集是确保检验质量的基础，主要有以下注意事项：

1.避免杂质干扰，特别是样品的定量分析。

2.标本采集部位和方法要正确。

3.标本标识要清晰无误。

4.无人为的溶血和混浊因素。

5.合理使用抗凝剂及防腐剂。

6.收集区温度不超过20℃。

7.微生物标本的收集严格无菌。

8.标本在采集后尽快送检。

如果不能及时检测，收集的样品应该按照检验规定的储存条件进行保存，如室温、冷藏、冰浴、温浴或防腐储存，将样品直立放置在稳定、干燥、黑暗、密封的环境中，避免摇晃，以免样品渗漏或溶血影响检测结果。

（谭 潭）