第一节 肿瘤标志物的筛选策略

一、潜在肿瘤标志物的鉴定

鉴定潜在肿瘤标志物的方法有很多，最经典是基于肿瘤及周围正常组织的生物学差异或药物代谢。随着肿瘤研究的不断深入，新技术层出不穷，现在常用发现潜在肿瘤标志物的方法有：高通量测序、组织芯片、质谱等。生物标志物在不同队列中有所区别，为了妥善使用这些技术获得的海量数据，必须要特别注意研究设计和数据分析，以便最小化假阳性结果。本节将详述开发候选生物标志物的流程，相关高通量测序和芯片技术等将在第四节详述。

二、肿瘤标志物筛选开发路线图

美国医学研究所（Institute of Medicine，IOM）委员会整合了肿瘤标志物筛选开发过程的相关意见，于2012年发布了如下路线图，以帮助研究者了解肿瘤标志物从科研假说开始到临床应用的整个流程（图2-1-1）。

三、开发候选肿瘤标志物的流程

2009年美国疾病控制中心的实践和预防基因组应用评估（Evaluation of Genomic Applications in Practice and Prevention，EGAPP）相关专家倡议，提出肿瘤标志物研究的三个关键概念：分析效度（analytical validity）、临床有效性（clinical validity）、临床实用性（clinical utility）。分析效度是指肿瘤标志物的检测在其使用的样本类型中是准确、可靠的。临床有效性是指肿瘤标志物测试基于生物学或临床结果将一个人群分成两个或更多个组的证据具有统计学意义。临床实用性是指高水平的证据表明肿瘤标志物测试可改善临床结果，或临床结果相等时成本或毒性更低。

（一）分析效度

分析有效性是对肿瘤标志物测定技术方面的要求，如测定的敏感性、特异性、重复性等。肿瘤标志物的测定结果受到很多因素的影响，如样品采集到处理的时间、储存条件、固定方法、处理后的储存条件和时间等。这些细节会影响结果的重现性，因此在开发新的潜在肿瘤标志物时，需要格外重视检测肿瘤标志物的预分析和分析测试方法。

肿瘤标志物的检测必须在实验室间有良好的一致性，目前已经针对关键标志物的检测开展了检测有效性确认计划，如针对乳腺癌患者的雌激素受体和HER2的检测。成功通过评估的实验室可以获得美国病理学家联合会或其他机构的认证。

（二）临床有效性

在技术上能测定出一个潜在肿瘤标志物后，必须对其临床或生物学有效性进行验证。基于肿瘤标志物应可靠地将整个群体分成不同的组。这需要在完全独立样本中进行验证。如果用于检测和验证的队列不是完全独立的，其临床有效性可能会被高估。关于验证方法尚存争议，有专家提出，独立验证应该由完全独立的研究人员进行。也有专家认为，初始验证应该由原始研究人员在独立样本队列中使用原始方法进行。

（三）临床实用性

不当的预后或预测性肿瘤标志物可能通过错误的治疗方式选择对患者带来伤害，或间接增加医疗费用。因此肿瘤标志物的临床实用性要求必须要有高水平的临床证据，评估其有效性和风险收益比。这方面最好的实例是结肠癌中KRAS突变的评估，不仅增进了传统病理评估，也产生了患者可能从抗EGFR治疗获益的信息。

也有专家提出在肺癌中优化肿瘤标志物发现的五大原则。原则一，选择由预期用途指导的检测方法；原则二，寻找对储存时间、温度、pH、酶、氧化应激依赖度低的稳定的标志物；原则三，检测方法应准确、精确、稳定，彻底检测实验室间、实验条件等的可重复性；原则四，在预计使用的临床环境中测试多个队列中的生物标志物，不鼓励进行病例对照研究，前瞻性队列研究较好；原则五，在更大的队列中与标准操作进行比较。这五个原则也适用于其他肿瘤中的生物标志物的优化。

四、整合助力肿瘤标志物研究

（一）多组学整合分析

肿瘤的发生发展是与基因组、转录组、表观组、蛋白组、代谢组等多个不同层次和水平密切相关的病理过程，单组学分析是传统肿瘤标志物的研究策略，只能反映肿瘤一个层面的变化，具有显著的局限性。通过多组学数据的联合分析，能更加全面系统地理解肿瘤的病理机制，为寻找有价值的肿瘤标志物提供更有价值的线索。

但是多组学数据的整合不能停留在简单整合阶段，应深入整合以揭示其内在联系。整合多组学数据首先要对不同来源的数据进行标准化处理，分析多个组学之间的关联性和特异性，在不同的组学层面对数据进行筛选研究。通过实验室模拟仿真等多种手段分析其内在联系，寻找潜在的生物标志物，其策略如图2-1-2所示。

Omics整合分析平台IMPaLA（Integrated Molecular Pathway Level Analysis）是一个基于网络的多组学整合分析工具，使用了来自11个数据库的3000多个代谢通路的数据。此外，R软件包WGCNA也可以基于相关性和网络拓扑结构对多组学数据进行整合分析。

（二）肿瘤标志物与放射组学和人工智能的整合

医学影像学常规用于肿瘤的诊断、治疗指导和疗效评价。高分辨率高速度CT的发展可提供庞大的数字化信息，拥有巨大的指导肿瘤诊断、预后和疗效评估的潜能。放射组学即Radiomics应运而生，应用大量的自动化数据特征化算法将感兴趣的领域的影像数据转化为具有高分辨率的可发掘的特征空间数据。通过对大量影像数据进行数字化的高通量定量分析，得到高保真的目标信息，综合评价肿瘤的各种表型，包括组织形态、细胞分子等各个层次。在人工智能飞速发展的今天，放射组学和人工智能的整合为寻找新的肿瘤标志物提供了新的手段。目前的研究热点包括及时识别感兴趣的领域，以及影像、临床和组学数据等在学习架构中的整合。

基于成像的深度学习和肿瘤标志物的组合在不确定肺结节的表征中可能非常重要。放射组学可以识别EGFR和KRAS突变的肿瘤。基于成像的定量分析可预测肺癌患者预后。血清标志物和放射学特征的整合较传统指标能更好地预测不确定肺结节患者的肺癌发生。已有数个报道表明，整合血清标志物、临床特征和可疑结节的影像学特征的预测模型准确地识别了恶性结节。综合模型优于单独使用血清标志物，如果进一步与人工智能整合，将发挥更好的效果。

五、小结

肿瘤诊断过程中目前尚有诸多问题，如待测样品复杂，单一标志物可信度差，特异性标志物匮乏且丰度低等。因此我们迫切需要发展高效、特异性的分子识别工具与识别策略，建立敏感、特异、快速的肿瘤标志检测新原理和新方法，设计多元肿瘤标志物检测体系，开发新的标记与信号提取方法，结合分子识别工具和原位成像技术，建立超高时空分辨的肿瘤标志物多模态、多层次检测新方法，构建肿瘤标志物分子图谱。

（黄灿华，孙晓东，张媛媛）