第二章 电泳技术

带电颗粒在电场作用下向其所带电荷相反的电极移动的现象，称为电泳（electrophoresis）。利用电泳现象进行物质的分离、纯化和鉴定的技术，称为电泳技术。

早在1808年，电泳现象即已被发现，但是直到1937年瑞典科学家Tiselins设计了世界第一台自由电泳仪，建立了“移界电泳法”，成功地将血清中的蛋白质分离成清蛋白，α1、α2、β和γ球蛋白五个组分后，电泳才作为一种分离方法逐步应用于生物化学研究。20世纪50年代，许多科学家着手改进电泳仪，并先后寻找到滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉及琼脂糖凝胶等支持物。60年代，Davis等利用聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支持物，并在此基础上发展了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。目前，电泳的种类和方式有了很大的发展，电泳的分辨率也不断提高，如利用双向电泳可将5000种蛋白质混合物的样品逐一完整地分开。电泳技术已成为生物化学和分子生物学研究中必不可少的技术手段，并广泛应用于生物科学、医学、工业、农业等领域的研究和生产实践。

第一节 电泳的基本原理

当把一个带净电荷的颗粒放入电场时，便有一个来自与它所带电荷性质相反电极的吸引力F作用于其上。F的大小取决于颗粒净电荷量（Q）及其所处的电场强度（E），它们之间的关系可用下式表示：

F=E·Q

由于F的作用，使带电颗粒在电场中向一定方向泳动。此颗粒在泳动过程中还受到一个相反方向的摩擦力F′的作用。根据Stoke公式，球形颗粒运动时，F′的大小取决于带电颗粒的形状、大小、所处介质的黏度及颗粒的移动速度，即：

F′=6πrηυ

式中r为颗粒半径，η为介质黏度，υ为颗粒移动速度。

当F=F′时，颗粒即在电场中以速度υ作匀速泳动，即：

EQ=6πrηυ

故：

由上式可知，带电颗粒在电场中泳动的速度与电场强度和带电颗粒的净电荷量成正比，与颗粒半径和介质黏度成反比。因此，在同一电场作用下，不同大小和净电荷量不等的带电颗粒在同一介质上（内）移动时，其移动速度不等，经过一定时间后，其移动距离不等，从而得以分离。利用这一原理也可用来对样品的纯度进行鉴定。

带电颗粒在单位电场中泳动的速度常用泳动度（mobility, m）或迁移率来表示。迁移率可由下式表示：

式中d为带电颗粒泳动的距离（cm）, l为支持物的有效长度（cm）, t为通电时间（s）, V为加在支持物两端的实际电压（V），故迁移率的单位为cm2·V-1·s-1。

迁移率也可由下式表示：

由上式可见，在一定条件下，任何带电颗粒都具有自己特定的迁移率，其大小决定于颗粒本身的性质，即所带电荷的数量、形状和大小，亦即取决于颗粒的电荷密度。两种不同的带电颗粒（如两种蛋白质分子）一般具有不同的迁移率。

许多在生物学上具有重大意义的分子都具有可解离的基团，在溶液中可形成带正电荷或负电荷的质点，在电场中便会向一定的电极移动，因此可通过电泳进行分离。例如，蛋白质分子具有许多可解离的酸性基团（如COO-）和碱性基因（如），是一个典型的两性电解质。蛋白质分子所带电荷的性质和数量取决于蛋白质本身的性质、溶液的pH值以及溶液的离子强度。不同蛋白质分子可解离基团各不相同，因此具有不同的等电点（pI）。当溶液的pH值等于pI时，蛋白质分子所带的净电荷等于零，在电场中不移动；当溶液pH值小于pI时，蛋白质带正电荷，电场中向负极移动；当溶液pH值大于pI时，蛋白质分子带负电荷，在电场中向正极移动。蛋白质的pI与溶液pH值相差愈大，其所带的净电荷就愈多。因此，不同蛋白质由于pI不同，在同一溶液中所带的净电荷也会不等，加之不同蛋白质的颗粒大小和形状也不相同，使得混合于同一溶液中的不同蛋白质在电场中具有不同的迁移速度，因此可通过电泳加以分离。此外，也可通过电泳进行核酸、核苷酸、氨基酸等物质甚至病毒颗粒、细胞的分离。

第二节 影响电泳速度的因素

一、样品性质

样品颗粒的形状、大小以及所带的净电荷量对泳动速度有较大的影响。一般来说，颗粒的净电荷量越大，或其直径越小，或其形状越接近球形，在电场中的泳动速度就越快。反之，则越慢。

二、电场强度

电场强度是指每1cm支持物上的电势降，也称电势梯度。以纸电泳为例，若滤纸长为10cm，两端电势降为150V，则电场强度为。根据电场强度的大小，可将电泳分为常压电泳和高压电泳。前者电场强度一般为2～20V/cm，后者为20～200V/cm。

电场强度对电泳速度起着十分重要的作用。电场强度愈高，带电颗粒的泳动速度愈快；反之，则愈慢。不过，电场强度增高时，电流强度会随之增大，使产热增加，可导致区带扩散，使分辨率降低，甚至导致样品失活，严重时会烧断滤纸或熔化琼脂糖凝胶等支持物。因此，高压电泳时常需附设冷却装置。

三、缓冲液

电泳中的缓冲液除参与导电外，其pH值和离子强度可直接影响颗粒的解离状态，从而影响电泳速度。

1.pH值

缓冲液的pH值是决定带电颗粒的解离程度，也即决定其带净电荷多少的决定因素。对蛋白质、氨基酸等两性电解质而言，缓冲液的pH值离其等电点愈近，则其所带的净电荷量愈大，电泳速度也愈快；反之，则愈慢。因此，分离蛋白质等样品时，应选择一个合适的pH值，使各种蛋白质所带净电荷量的差异增大，以利于分离，并缩短电泳时间。一般常用的电泳缓冲液pH值范围在4.5～9.0之间。

2．离子强度

缓冲液的离子强度较低时，缓冲液所载的电流降低，样品所载的电流相应增加，因此，电泳的速度较快。但是，当离子强度过低时，缓冲液的缓冲容量小，不易维持pH值的恒定，同时样品的扩散比较严重，使分辨率明显降低。

缓冲液离子强度较高时，缓冲液所载的电流增加，样品所载的电流则降低，因此，样品的电泳速度减慢。离子强度过高时，由于总电流的增加而使产热明显增加，将对电泳产生不利影响。

因此，电泳选择离子强度时要两者兼顾，一般离子强度的选择范围在0.02～0.2之间。

缓冲液离子强度的计算：

式中I为离子强度，C为离子的摩尔浓度，Zi为离子的价数。

例如：0.15mo1/L NaCl溶液的离子强度为：

0.15mo1/L ZnSO4溶液的离子强度为：

由此可见，多价离子会使离子强度增高，所以电泳缓冲液常用单价离子化合物配制。

四、支持介质

电泳时选用的支持介质应是惰性较大的材料，不与被分离的样品或缓冲液发生化学反应，且应具有一定的坚韧度。支持介质的结构、性质对电泳速度也有较大的影响。

1．吸附

某些支持介质的表面对被分离物质具有吸附作用，使分离物质滞留而降低电泳速度。吸附可使样品的移动不能形成一条很清晰的区带，出现拖尾现象，因而降低了电泳的分辨率。滤纸的吸附作用最大，醋酸纤维素薄膜的吸附作用很小。

2．电渗

在电场中，液体对固体的相对移动称为电渗。当支持介质不是绝对惰性物质时，其表面含有的一些离子基团可以吸附溶液中带相反电荷的离子，使靠近支持物的溶液层相对带电。在电场作用下，此溶液层会向相反电极移动。例如，在纸电泳时，由于滤纸的纤维素含有羟基，使表面带负电荷，与表面接触的水溶液则带正电荷，在电场作用下，该溶液层向负极移动。由于电渗现象与电泳同时存在，所以会对电泳时颗粒的泳动产生影响。当颗粒的泳动方向与电渗方向一致时，则加快颗粒的泳动速度，当颗粒的泳动速度与电渗方向相反时，则降低颗粒的泳动速度。

电渗现象可用不带电的有色颜料或用有色的葡聚糖点在支持介质的中间，经电泳后可观察电渗作用的方向和强度。

3．分子筛

有些支持物如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等都具有大小不等的筛孔，对形状、大小不同的颗粒会产生程度不同的阻滞作用，从而影响电泳速度，这称为分子筛效应。筛孔较大或分子较小时，颗粒泳动速度较快；反之，则泳动速度较慢。支持物的分子筛作用有助于某些单纯靠电荷效应不能奏效的化合物的分离，从而提高了电泳的分辨率。

第三节 常用的电泳支持介质

根据电泳是在溶液还是在固体支持物中进行，可将电泳分为自由电泳和支持物电泳两大类，以支持物电泳更常用。电泳的支持介质种类很多，不同支持介质的结构和性质不同，对电泳的影响也不相同，可根据需要加以选择。

一、醋酸纤维素薄膜（Cellulose Acetate Membrane）

醋酸纤维素即纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而成。当将它溶于丙酮等有机溶液后，即可涂布成均一细密的微孔薄膜，厚度以0.1～0.15mm为宜。太厚吸水性差，分离效果不好；太薄则缺乏应有的机械强度而易碎。

二、琼脂糖凝胶（Agarose Gel）

琼脂糖是由D-半乳糖和3,6脱水的L-半乳糖连接构成的多糖链，是不带电荷的中性物质。这种多糖链在100℃左右时呈液态，当温度下降到45℃以下时，它们之间以氢键方式相互连接，就成了线性的双链单环的琼脂糖，经凝聚即成胶冻状的琼脂糖凝胶。

琼脂糖是从琼脂中分离出来的。天然的琼脂是一种多聚糖，主要由琼脂糖（约占80%）及琼脂胶组成。琼脂胶是一种含较多硫酸根和羟基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用进而影响电泳速度和分离效果，因此，在制备过程中要尽可能将琼脂中的琼脂胶除去，才能得到不带电的琼脂糖。

目前多采用琼脂糖凝胶作为电泳支持物进行平板电泳，其优点如下：

（1）琼脂糖凝胶结构均匀，含液体量大（占98%～99%），近似自由电泳，样品扩散较自由电泳小，对样品吸附极微。因此，电泳后区带整齐，分辨率高，重复性好。

（2）液相与固相无明显分界，电泳速度快。

（3）琼脂糖凝胶透明且无紫外吸收，电泳过程和结果可直接用于紫外监测及定量测定。

（4）电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。

（5）电泳及染色后，可制成干膜长期保存。

（6）操作方便，设备简单，所需样品量少，样品不需事先处理就可直接电泳。

琼脂糖凝胶电泳已广泛应用于蛋白质、核酸等生物大分子的分离、纯化和鉴定。将琼脂糖凝胶电泳与免疫化学相结合发展成的免疫电泳技术，能鉴别其他方法不能鉴别的复杂体系，由于有了超微量技术，0.1 μg蛋白质就可被检出。

三、聚丙烯酰胺凝胶（Polyacrylamide Gel, PAG）

聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（acrylamide, Acr）和交联剂N, N-甲叉双丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide, Bis）在加速剂和催化剂的作用下聚合交联形成的具有三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gelelectrophoresis, PAGE）。与其他凝胶相比，聚丙烯酰胺凝胶具有下列优点：

（1）在一定浓度范围时，凝胶透明，机械强度好，弹性大，有利于电泳后进行各种处理。

（2）凝胶是—C—C—C—C…连接的多聚体，侧链除不活泼的酰胺基外，无其他离子基团，故化学性能稳定，与被分离物不发生化学反应，且无电渗作用。

（3）样品不易扩散，所需样品量少（1～100μg）。

（4）凝胶孔径可调节。通过改变单体浓度或单体与交联剂的比例，就能得到孔径不同、范围广泛的凝胶，故其应用广泛，可用于多种物质的分离和鉴定。

（5）分辨率高，尤其是不连续凝胶电泳，集浓缩效应、分子筛效应和电荷效应为一体，因而较醋酸纤维素薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳等有更高的分辨率。

1．凝胶聚合原理

聚丙烯胺凝胶由Acr和Bis聚合而成。Acr和Bis单独存在或混合在一起时是稳定的，但在有自由基存在时，它们就会聚合成凝胶。根据引发产生自由基的方法，聚合分为化学聚合和光聚合两种。

（1）化学聚合：化学聚合的催化剂一般是过硫酸铵（AP），加速剂是脂肪族叔胺，如四甲基乙二胺（TEMED）、三乙醇胺和二甲基氨丙腈等，其中以TEMED最好。当Acr、Bis和TEMED的水溶液中加入过硫酸铵时，过硫酸铵[（NH4）S2O8]立即产生自由基：

与Acr接触发生反应，使Acr的双键打开而“活化”。活化的Acr彼此连接形成多聚体长链，含有这种多聚体长链的溶液尽管比较黏稠，但还不能形成凝胶，因为这些长链能向彼此滑动，只有在交联剂Bis存在时，才能使两链之间交联而形成网状结构的凝胶。

化学聚合时，Acr和Bis聚合的速率与过硫酸铵浓度的平方根成正比，并且在碱性条件下反应迅速。例如，7%的丙烯酰胺溶液要完全聚合，在pH值为8.8时，仅需30分钟；而pH值为4.3时，则需90分钟。此外，温度、氧分子和杂质都会影响聚合速度。一般在室温下比在零度以下聚合快，溶液预先抽气的比不抽气的聚合快。

（2）光聚合：光聚合的催化剂是核黄素。光聚合过程是一个光激发的催化反应过程。在氧及紫外线作用下，核黄素生成含自由基的产物，自由基引发Acr和Bis聚合形成凝胶。用核黄素催化时，可不加TEMED，但若加入TEMED会使聚合速度加快。光聚合要有痕量的氧存在，但过量氧能淬灭自由基，阻止聚合，故聚合反应时要抽气以减少氧含量。聚合反应的温度以20～25℃为宜。

光聚合的优点是催化剂核黄素的用量极少（1mg/100mL），对分析样品无任何不良影响；聚合时间可以自由控制——改变光照时间和强度，可使聚合作用延迟或加快。但光聚合形成的凝胶呈乳白色，透明度较差；光聚合的凝胶孔径较大，而且随时间延长而逐渐变小，不太稳定，重复性较差，所以一般用它制备大孔胶较合适。

2．凝胶的孔径

聚丙烯酰凝胶的孔径大小是由单体和双体在凝胶中的总浓度（T），以及双体占总浓度的百分含量即交联度（C）决定的。凝胶总浓度和交联度的计算公式如下：

式中a代表Acr的质量（g）, b代表Bis的质量（g）, V代表溶液的体积（mL）。

通常，凝胶的弹性、透明度和筛孔的孔径是随着凝胶总浓度的增加而降低的。当总浓度一定时，交联度增加，将导致筛孔直径减小。Richard等在1965年提出了适合于确定凝胶总浓度在5%～20%范围内的交联度的经验公式：

C=6.5%-0.3T

依照上述公式，当选用总浓度T分别为5%和10%时，其适合的交联度分别为5%和3.5%。

3．凝胶浓度的选择

凝胶的特性是具有分子筛效应。很明显，大分子颗粒进入凝胶的程度既取决于样品分子的大小，又取决于凝胶的平均孔径。如果凝胶的平均孔径小于颗粒的直径，那么无论颗粒所带电荷的多少以及电场强度如何，它们都不能进入凝胶。所以，分离不同分子量的混合物时，只有选择适宜浓度的凝胶才能得到满意的效果。在实际工作中，当分析一个未知样品时，常常选用7.5%的标准凝胶或是4%～10%的梯度凝胶作试验，以便选到理想浓度的凝胶。当分离物的分子量已知时，凝胶浓度的选择可参考表1-2-1。

第四节 电泳后的染色

经电泳分离的各种生物分子本身一般无颜色。因此，电泳后需进行染色，使它们在支持物的相应位置显示出区带，从而检测其纯度、含量及生物活性。不同生物分子的染色方法不同。以下主要介绍蛋白质和核酸的几种常用染色方法。

一、蛋白质染色

染色液的种类繁多，各种染色液的染色原理不同，灵敏度各异，使用时可根据需要加以选择。常用的染色液包括：

1．氨基黑10B（Amino Black 10B）

氨基黑10B是酸性染料，λmax在620～630nm间，其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐。氨基黑10B是最常用的蛋白质染料之一。但用氨基黑10B染SDS-蛋白质时效果不好。此外，氨基黑10B染不同蛋白质时，着色度和色调不一（呈蓝、黑、棕等色），作凝胶样本扫描时误差较大，故一般只用于定性分析。

2．考马斯亮蓝R-250（CBBR-250）

CBBR-250的λmax在560～590nm间，染色灵敏度较氨基黑10B高5倍，尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色。但蛋白质浓度超过一定范围时，染色不符合Beer定律，故进行定量分析时应加以注意。

3．考马斯亮蓝G-250（CBBG-250）

CBBG-250比CBBR-250多两个甲基，λmax在590～610nm间，染色灵敏度不如CBBR-250，但比氨基黑10B高3倍。其优点是它在三氯醋酸中不溶而成胶体，可克服CBBR-250在脱色时易溶解出来的缺点；能选择性染蛋白质而几乎无本底色；染色稳定，重复性好，适用于作定量分析。

4．银染色法

银染色法的机制尚不清楚，可能与摄影过程Ag+的还原原理相似。该染色法灵敏度很高，较CBBR-250灵敏100倍，因此常用于微量蛋白质凝胶电泳后染色，Demoreno等人综合了银染色法和考马斯亮蓝染色法的优点，建立了一种与考马斯亮蓝染色法相结合的银染色法，其灵敏度比银染色法提高数十倍，应用范围更加广泛。

5．脂蛋白染色

油红O可专一地与脂蛋白结合，特异性显示脂蛋白的区带。苏丹黑B也是一种常用的染料，用于琼脂糖凝胶电泳及PAGE中脂蛋白的预染。

6．糖蛋白染色

利用糖蛋白组成的特点，采用过碘酸-Schiff试剂对糖蛋白进行特异性染色。甲苯胺蓝可用于含酸性多糖的糖蛋白染色。

7．特异性酶的染色

电泳进行酶谱分析时，常利用酶的特异性催化作用，将酶促反应直接或间接地与能够生成深色不溶性产物的化学反应相偶联，从而显示酶蛋白区带的存在，并通过颜色深浅显示酶活性的高低。

二、核酸染色

1．溴化乙锭（Ethidium Bromide, EB）

溴化乙锭是最常用的核酸荧光染料，既可用于双链DNA的染色，也可用于单链DNA和RNA的染色。EB可嵌入核酸链的碱基之间，在紫外线激发下发出橘红色荧光。EB-核酸复合物中的EB发出的荧光，比游离于凝胶中的EB发出的荧光强度高10倍。因此，一般无需漂洗背景即可直接在紫外灯下观察核酸区带。

2．其他

除EB外，还有多种染料能对DNA或RNA进行染色，见表1-2-2。