实验六 蛋白质的沉淀反应
当维持蛋白质胶体溶液的稳定因素（水化层和电荷）遭受破坏时，蛋白质即沉淀析出。若系非变性沉淀，例如加入中性盐或在低温下加入有机溶剂脱水，则除去沉淀剂，蛋白质仍可溶解，此即可逆的沉淀。若系变性沉淀，例如加入重金属盐类、沉淀生物碱的试剂或加热，则沉淀不易除去，沉淀常不能再溶解，此即不可逆的沉淀反应。
（一）蛋白质的盐析
【原理】
当蛋白质溶于中性盐（硫酸铵、硫酸镁、氯化钠等）时则蛋白质沉淀析出，称为盐析作用。盐析作用包括两种过程：①大量电解质破坏了蛋白质的水化层从而出现沉淀。②电解质中和了蛋白质分子所带的电荷而沉淀。
中性盐能否沉淀各种蛋白质常决定于中性盐的浓度、蛋白质的种类、溶液的pH值，以及蛋白质的胶体颗粒。颗粒大者比颗粒小者容易沉淀，如球蛋白多在半饱和的硫酸铵溶液中析出，而清蛋白则常在饱和的硫酸铵溶液中析出。
【操作】
（1）取5mL鸡蛋白溶液于中试管中，加入等量饱和硫酸铵溶液，混匀，静置20分钟后，则球蛋白全部析出。
（2）过滤、收集透明滤液，滤液中含有清蛋白。若滤液混浊，须重复过滤至透明为止。
（3）取1mL清滤液加固体硫酸铵约0.5g使达饱和，边加边振摇至溶液出现浑浊。再向浑浊液（不含硫酸铵结晶颗粒）加1.5～2.0mL水，观察结果。
【试剂】
（1）1∶10鸡蛋白溶液。
（2）饱和硫酸铵溶液，称取377g硫酸铵溶于500mL 20℃的水中。硫酸铵在20℃的水中溶解度为754g/L水。配制时须称取稍过量的硫酸铵使溶液中有若干固体存在，同时可加热助溶。
（3）固体硫酸铵。
（二）重金属盐类沉淀蛋白质
【原理】
蛋白质在碱性溶液中，带有较多的负电荷，当它与带正电荷的重金属离子结合时即生成不溶解的沉淀。
重金属盐类沉淀蛋白质能引起蛋白质变性，而中性盐类即使加入量很多也不致改变蛋白质原来的性质。
【操作】
取试管1支，加入1∶10鸡蛋白溶液1mL及0.5%NaOH溶液1滴混匀，再加入0.5%硫酸锌溶液6滴，观察结果。
【试剂】
（1）1∶10鸡蛋白溶液。
（2）0.5%NaOH溶液。
（3）0.5%硫酸锌溶液。
（三）沉淀生物碱的试剂沉淀蛋白质
【原理】
蛋白质溶液的pH值小于等电点时，蛋白质分子带较多的正电荷，它能与沉淀生物碱的试剂中的负离子结合而沉淀。
此沉淀常可在碱性溶液中再溶解。属于沉淀生物碱的试剂有钨酸、苦味酸、鞣酸等。
【操作】
（1）取1支试管，加入1∶10鸡蛋白溶液1mL,10%HCl 1滴，混匀，再加入10%磺基水杨酸溶液2滴。
（2）另取1支试管，加入1∶10鸡蛋白溶液1mL及10%NaOH溶液数滴，再加入10%磺基水杨酸溶液2滴。
比较两管溶液的变化。
【试剂】
（1）1∶10鸡蛋白溶液。
（2）10%HCl溶液。
（3）10%NaOH溶液。
（4）10%磺基水杨酸溶液。
（四）加热沉淀蛋白质
【原理】
由于温度升高，破坏了蛋白质分子内部的化学键会引起蛋白质变性，因此几乎所有蛋白质都可因加热而凝固。
蛋白质在其等电点时不带电荷，或带等量的正负电荷，此时若温度升高则容易出现沉淀。在酸性或碱性溶液中，蛋白质分子带有正或负电荷，较为稳定。如过酸或过碱则易变性，此时若温度升高，虽变性却并不沉淀。在冷却后，加酸或加碱调节pH值达蛋白质的等电点时，则有沉淀析出。
【操作】
（1）取4支试管，编号，按表2-6-1加入试剂。
表2-6-1
（2）将4支试管同时放在沸水浴中加热，观察并记录各管蛋白质出现的现象，解释变化原因。
（3）取出试管，冷却后于第3管中慢慢滴入10%NaOH溶液，并观察现象。
（4）向第4管中慢慢滴入10%醋酸，并观察现象。
【试剂】
（1）1∶10鸡蛋白溶液。
（2）1%醋酸。
（3）10%醋酸。
（4）10%NaOH溶液。
（五）尿蛋白的定性检查
【原理】
尿蛋白遇热凝固变性，呈白色浑浊，加乙酸使至蛋白质的等电点，即可除去磷酸盐或碳酸盐所形成的白色浑浊。正常人尿蛋白甚微，平均每日30～75mg，一般方法不易检出。
【操作】
（1）取小试管4支，标号，分别加入1∶10鸡蛋白溶液、自己尿液以及待检尿液1及2到试管内约2/3处。
（2）手执试管底部，使火焰加热于液柱上段至沸，如有蛋白质，即可看到白色沉淀，如蛋白质较多，可发生凝固。此时再滴入1%醋酸2～3滴，若沉淀消失，表示沉淀物质是磷酸盐，如沉淀不消失，反而更明显，则表示尿中有蛋白质。有时，煮沸后虽不浑浊，但加酸后浑浊出现，也表示管中有蛋白质。
上述方法既是尿蛋白定性也是半定量的方法之一。可按表2-6-2粗略估计尿中蛋白质含量。
表2-6-2
【试剂】
（1）1∶10鸡蛋白溶液。
（2）1%（V/V）醋酸溶液（取冰醋酸1mL加水至100mL）。
（3）蛋白尿（配制两种浓度不同的蛋白尿为待检尿）。